<연구결과 보고서>

“착유우 사료 내 복합생균제 KSB90복합미생물생균제첨가급여에 따른 반추위 미생물 발효성상 및 산유성적에 미치는 영향 검증연구

2017.01.04.

연구책임자: 최낙진교수 이학박사

연구기관: 전북대학교 반추동물영양학 실험실

1. 연구배경

축산업에서 항생제는 가축의 생산성 증진 및 면역강화 등을 목적으로 하여 널리 사용되어왔다. 그러나 최근 항생제의 내성과 체내 축적에 대한 문제가 제기되면서 가축 생산성 증진을 목적으로 하는 항생제의 사용이 금지되었다. 이에 항생제에 대한 대체물질로 천연식물추출물 및 생균제 등이 많은 관심을 받고 있으며, 그 중에서도 동물의 장 내에서 유익한 미생물 균총을 만들 수 있는 생균제에 대한 관심이 증가하고 있다(Fuller, 1989).

생균제(Probiotics)는 ‘생명을 위한(for life)’이라고 하는 의미의 어원을 가지고 있다. 생균제라는 용어가 처음으로 사용된 것은 1953년으로 거슬러 올라가며, 이 후 Ray Fuller는 ‘살아있는 미생물을 이용한 사료 첨가물질로 가축 장관내 미생물 균형을 개선하여 가축에게 이로움을 주는 물질’로 정의하였다. 생균제는 외부 스트레스(사육환경, 대사적 스트레스)로 인하여 균형이 깨져버린 장내 균총의 균형을 유지시켜 유익한 균이 우점될 수 있도록 한다. 그리고 가축의 면역체계발달과 기능조절에 있어 중요한 역할을 하며, 장내 병원균들과 유익균들 간의 영양소(기질)에 대한 경쟁적 배제를 통해 병원균의 생장을 억제시킨다(Hinton 등, 1991; Fuller, 1989). 장관내로 유입된 생균제는 장내에서 젖산 및 초산과 같은 유기산, 과산화수소 그리고 박테리오신과 같은 천연 항생물질을 생산하여 병원균 생장을 억제시킨다. 생균제 미생물의 강력한 장점막 부착력을 통해 장내 미세환경(micro-environment)에서 서식하며 영양소의 분해와 흡수를 돕고 병원균의 장점막 침투를 억제하여 질병을 예방한다. 생균제로 인한 신속한 장내 균총의 회복은,  Bifidobacterium 과 같은 유익균 발육에 최적인 환경을 제공하고, 그 증식을 촉진하여, 장내 pH 를 낮춰 줌으로써 유해 병원균으로부터 상피세포를 보호하는 효과를 나타낸다(Bongaerts 등, 2005; Champbell 등, 1992; Goossens 등, 2005). 생균제 미생물은 대사과정 중에 비타민, 효소 및 미지성장인자 등을 생산하고, 이들 대사물질들은 장 점막세포의 분화 및 성숙을 증가시켜 영양소 이용률 개선 및 장관 면역 발달에 기여하며, 궁극적으로 가축의 생산성 및 면역 능력을 향상시킨다(Smith, 1985; Mohan 등, 1996). 특히 생균제는 항생제와는 다르게 장내의 균총을 교란시키지 않으면서 정상적 균총 구성을 유지하도록 도와주는데 효과적이다(Senok 등, 2005). 이와 같은 생균제의 긍정적 영향 때문에 항생제 대체제로서의 적용에 관한 많은 연구들이 진행되고 있다. 특히 착유우에 있어 생균제 급여 효과에 관한 기존 연구결과들을 통하여 유생산량 증가 및 체세포수 감소의 효과를 찾아볼 수 있다(Joo 등, 2004). 뿐만 아니라, Kim 등(2001)의 결과에 의하면 유지방과 무지고형분이 증가하는 효과도 확인할 수 있었다.

생균제로 사용되는 균주들로는 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Bacillus, Clostridium, Rhodobacter 등의 세균, Saccharomyces를 포함하는 효모, Aspergillus을 포함하는 곰팡이류 등이 있고, 상업적인 가축 생균제는 단일 혹은 복합 균주 형태로 구성된다. 생균제의 효과는 사용되는 미생물의 종류에 영향을 받으며, 그 외 가축의 생리적 상태, 사료의 종류, 약물 적용여부 및 사육환경 등과 같은 다양한 요인들의 영향을 받는다. 기존 연구 결과들에 따르면, 다양한 환경적 요인을 비교적 덜 받으며 생균제의 효과를 얻기 위해서는 단일 생균제를 이용하는 것보다는 복합생균제를 이용하는 것이 더 바람직하다(Kim 등, 2001).

본 연구는 다양한 균주를 활용하여 제작된 KSB90복합미생물 생균제((주) 씨드바이오)의 사료첨가 급여가 반추위 발효특성과 착유우 유생산성(유량 및 유성분)에 미치는 영향을 알아보기 위한 목적으로 수행되었다.

2. 재료 및 방법

실험 1. In vitro 반추위 발효 시험

1) 공시축 및 사양관리

충청남도 부여군에 소재한 목장에서 반추위 캐눌라를 장착한 홀스타인 2두(체중 700 ± 50 kg)를 공시하였다. 공시축은 하루에 2 회 오전(08:00 시)과 오후(17:30 시)에 에뉴얼 라이그라스 8 kg과 젖소 육성 배합사료 3 kg을 급여하였다. 미네랄 블록 및 물은 자유섭취 하도록 하였다.

2) 시료준비 및 실험설계

반추위 발효를 위한 기질로 사용된 TMR은 2 mm screen이 장착된 분쇄기(Cutter mill, IKA MF10.1, Staufen, Germany)를 이용하여 분쇄하였다. 시험 설계는 무첨가(대조구)와 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가구(시험구)로 설정하였다. 배양 시간은 0, 3, 6, 9, 12 및 24시간 동안 각각 3 반복하였으며, Tilley와 Terry (1963)의 방법에 따라 수행하였다.

3) 반추위액 준비

반추위액은 공시축의 오전사료 급여시간 전에 채취하여 4 겹의 cheese cloth에 걸러 O2-free CO2가 충진 된 보온용기에 담아 1 시간 안에 실험실로 운반하였다. 잔여 사료입자를 제거하기 위해 8 겹의 cheese cloth로 다시 걸러낸 반추위액을 McDougall's buffer (McDougall, 1948)와 1:4 비율로 희석하여 O2-free CO2를 분사하고 혐기상태를 유지하면서 실험에 사용하였다.

4) 분석항목 및 방법

모든 배양시간 별 총 가스 발생량은 유리 주사기를 이용하여 측정하였다. 발효가 종료된 serum bottle을 개봉 후, pH meter (S20 Seven Eazy™, Mettler-Toledo)를 이용하여 반추위액의 pH를 측정하였다. 반추위액 내 암모니아태 질소 함량은 Chaney와 Marbach (1962)의 방법에 따라 수행하였다. 4,000 rpm으로 원심분리한 사료입자가 제거된 반추위액의 상등액 20 uL에 1 mL 의 phenol color reagent (50 g/L phenol, 0.25 g/L sodium nitroferricyanide)와 1 mL의 alkali reagent (25 g/L NaOH, 16.8 mL/L sodium hypochlorite (4~6%))를 완전히 혼합 후 37℃에서 15 분간 반응시키고, 분광광도계(Optizen UV2120, Mecasis, Korea)를 이용하여 630 nm에서 측정 하였다. 반추위액 내 휘발성 지방산은 Erwin 등 (1961)의 방법에 따라 진행되었다. 4,000 rpm에서 원심분리된 반추위액 상등액 1 mL에 HPO3 200 uL를 첨가하여 30 분간 정치 후 13,000 rpm에서 원심분리한 후에 상등액을 취하여 분석에 사용하였다. 휘발성 지방산 분석은 NukolTM, fused silica capillary column(0.25mmi.d.×0.25μmfilm×30mlength, SUPELCO, USA)가 장착된 gas chromatography (HP7890, Agilant, CA, USA)을 이용하여 수행하였고, 분석하였고 oven 및 injector 와 detector 온도는 각각 180℃, 220℃ 및 200℃ 였다.

5) 통계분석

처리 효과에 대한 통계적 유의성 검정은 독립 표본 평균비교 방법으로 수행하였다. 평균 비교는 student t-test 방법을 사용하였고, 5%의 유의수준을 기준으로 하였다. 통계분석은  SPSS program (Version 18, IBM, NewYork, USA)을 이용였다.

실험 2. 사양시험

1) 공시축 및 사양관리

전북 고창군에 소재한 목장에서 평균 2.95±0.07 산차, 평균유량 27.93±0.42 kg, 평균착유일수 200.18±5.28 일인 198 두의 홀스타인 착유우를 사용하였다. 시험사료와 물은 자유 급여하였다. 시험 기간은 총 8 주 동안 진행 하였고, 착유횟수는 1 일 2 회(06:00 시와 18:00 시) 착유하였다.

2) 분석항목 및 분석방법

분석항목은 유량, 유지방, 유단백, 무지고형분, 락토오스, 체세포수 및 MUN (milk urea nitrogen)으로 설정하였고 원유의 일반성분 분석은 LactoScope (MK2, Delta Instruments, the Netherlands)을 이용하여 분석에 사용하였다.

3) 통계분석

통계분석은 시료샘플링 주령(0, 3 및 8 주차)별 비교는 공분산분석을 통하여 처리효과를 분석하였으며 공분산요인은 산차와 착유일수로 설정하였다. 전체 비교는 혼합모형을 사용하였고 고정 변수는 시험구, 랜덤 변수는 월, 산차, 비유시기로 설정하였다. 분석에 사용된 통계프로그램은 R statistical analysis program (Version 3.3.1)을 사용하였다.

3. 결과 및 고찰

실험 1. In vitro 반추위 발효 시험

1) 반추위 발효 pH

반추위 pH는 6.68 ~ 7.00 범위로 나타났으며, 미생물 활동의 적정범위인 5.8 ~ 7.2 내에 조사되어(Hiltner 와 Dehority, 1983), 처리구간 통계적 유의성에 관계없이 KSB90복합미생물 생균제 첨가에 따른 반추위 발효에 부(-)의 영향은 없는 것으로 확인되었다.

표 1. 복합생균제 첨가가 반추위 in vitro pH에 미치는 영향
배양시간, h	대조구	시험구	SEM1	P value
0	6.77	6.78	0.002	0.178
3	6.68	6.70	0.004	<0.05
6	6.99	6.99	0.002	0.374
9	6.99	6.99	0.002	0.423
12	6.99	7.00	0.003	0.057
24	6.90	6.91	0.005	0.349
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% B90복합미생물 생균제 첨가. 1Standard error of the mean.

2) 총 가스 발생량

전 배양시간대에서 대조구보다 시험구에서 상대적으로 총 가스 발생량이 높았다(p<0.05, 표 2). 이는 복합생균제 첨가로 인한 급여된(섭취한) 사료가 반추위 내에서 미생물에 의한 발효가 보다 더 활성화 된 것으로 확인되었다.

표 2. 복합생균제 첨가가 반추위 in vitro 가스발생량(mL)에 미치는 영향
배양시간, h	대조구	시험구	SEM1	P value
3	11.00	14.33	0.882	<0.05
6	20.00	26.00	1.414	<0.05
9	34.33	39.33	1.276	<0.05
12	43.00	51.67	1.961	<0.05
24	62.33	70.67	2.029	<0.05
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가. 1Standard error of the mean.

3) 암모니아태 질소

일반적인 반추위 내 암모니아태 질소의 적정량은 최소 5 ~ 8 mg/100 mL에서 최대 29 mg/100 mL로 알려져 있다(Stiles 등, 1970). 본 실험에서 조사된암모니아태 질소생성량은 1.79 ~ 6.41 mg/100 mL로 조사되었다. 배양 6, 12 및 24 시간대에서 총 가스 발생량은 시험구가 대조구보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05, 표 3). 따라서, 복합생균제 첨가에 의하여 반추위 내 단백질 이용 효율이 향상된 것으로 보인다.

표 3. 복합생균제 첨가가 반추위 in vitro 암모니아태 질소(mg/100mL)에 미치는 영향
배양시간, h	대조구	시험구	SEM1	P value
0	2.87	3.55	0.154	0.102
3	4.37	4.88	0.163	0.113
6	3.03	3.39	0.107	<0.05
9	2.87	2.87	0.040	1.000
12	1.79	2.47	0.169	<0.05
24	3.98	6.41	0.597	<0.05
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가. 1Standard error of the mean.

4) 휘발성지방산 생성량

총 휘발성지방산 생성량은 12시간대 시험구가 대조구보다 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(p<0.05, 표 4). 그리고, 전 배양시간대에 걸쳐 전반적으로, 반추동물의 주요 에너지 및 영양소원으로 이용되는 총 휘발성 지방산은 두 처리구간 통계적 유의성으로 없지만, 수치적으로 높은 경향을 보인 것은 에너지 및 영양소 이용 효율 측면에서 긍정적 가능성을 제시해 주고 있다.  유지방 합성의 전구물질인 초산(acetate)은 전시간대 유의성이 없었지만 대조구보다 시험구에서 수치적으로 높게 조사되었으며, 이는 실제 사양실험에서 KSB90복합미생물 생균제 첨가급여에 의한 유지방함량이 향상된 것으로 확인되었다.

배양 9, 12 및 24시간대의 프로피온산(propionate) 생성량의 경우,시험구가 대조구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 뷰티릭산(butyrate)의 경우, 배양 24시간을 제외한 전시간대에서 대조구에 비하여 시험구에서 높게 나타났으나 통계적 유의성은 관찰되지 않았다(P>0.05). 발러릭산(valerate)의 경우, 배양 12시간대에서만 시험구가 대조구에 비해 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 초산과 프로피온산의 비율인 A/P 비율은  모든 배양 시간에서 적정 범위내에 속하는 것으로 나타났다.

표 4.KSB90복합미생물 생균제 첨가가 반추위 in vitro 총 휘발성지방산 생성량(mM)에 미치는 영향
배양시간, h	대조구	시험구	SEM1	p-value
Total VFA
0	23.91	23.61	0.169	0.468
3	33.48	34.19	0.297	0.374
6	37.16	34.30	1.205	0.400
9	42.92	46.55	1.291	0.193
12	37.20	44.34	1.874	<0.05
24	66.37	72.43	2.119	0.175
Acetate
0	14.53	14.15	0.134	0.170
3	20.04	19.65	0.210	0.445
6	21.98	20.61	0.605	0.335
9	25.27	25.41	0.331	0.863
12	22.75	24.73	0.589	0.089
24	37.97	40.39	1.383	0.506
Propionate
0	4.76	4.67	0.049	0.474
3	7.87	8.35	0.160	0.146
6	8.93	8.69	0.243	0.728
9	10.45	12.78	0.706	<0.05
12	8.80	12.25	0.870	<0.05
24	15.75	19.43	1.079	<0.05
Butyrate
0	3.59	3.62	0.034	0.774
3	4.46	4.67	0.098	0.389
6	4.75	4.20	0.180	0.158
9	5.64	6.06	0.241	0.520
12	4.38	5.51	0.295	0.110
24	9.24	9.17	0.089	0.787
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가. 1Standard error of the mean.

표 4. 계속
배양시간, h	대조구	시험구	SEM1	p-value
Valerate
0	1.27	1.17	0.029	0.099
3	1.44	1.52	0.060	0.597
6	1.51	1.33	0.063	0.306
9	1.94	2.30	0.111	0.185
12	1.27	1.85	0.152	<0.05
24	3.42	3.45	0.101	0.915
A/P ratio
0	3.06	3.03	0.024	0.305
3	2.50	2.36	0.033	0.161
6	2.46	2.31	0.029	0.141
9	2.38	1.99	0.073	<0.05
12	2.59	2.02	0.099	0.076
24	2.41	2.08	0.067	0.102
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제첨가. 1Standard error of the mean.

실험 2. 사양시험

1) 주령별(0, 3 및 8주차) 유량 및 유성분 변화

본 현장적용시험 개시 전 산유량, 유지방 및 유단백에서 유의성이 없었던 것으로 보아 공시축이 잘 배치되었음을 확인할 수 있다(표 5). KSB90복합미생물 생균제 급여 3 주 후, 시험구가 대조구에 비하여 산유량과 유지방이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다(p<0.05, 표 6). 유단백질 함량의 경우, 통계적 유의성은 관찰되지 않았으나,  시험구에서 대조구에 비해 높게 나타났고, 체세포수는 대조구보다 시험구가 낮은 경향을 보였다(P=0.06). 사양시험 8 주차 성적를 분석한 결과, 시험구의 유지방이 대조구에 비하여 유의적으로 증가되는 결과를 보였으며(p<0.05), 유량과 유단백질 함량 또한 증가되는 경향을 확인할 수 있었다(표 7). KSB90복합미생물 생균제 급여시 체세포수는 89% 유의수준에서 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.

표 5. 시험시작 전 공시축의 유량 및 유성분
	대조구		시험구		유의성
	평균	표준편차	평균	표준편차	p-value
유량 (kg)	27.89	7.85	29.32	9.27	0.47
유지방 (%)	3.51	0.31	3.53	0.45	0.59
유단백 (%)	3.45	0.21	3.49	0.18	0.12
무지고형분 (%)	9.57	0.21	9.42	0.25	<0.05
락토오스 (%)	4.97	0.20	4.80	0.23	<0.05
체세포수 (×1,000)	205.71	195.54	246.56	75.71	0.06
MUN (%)	18.70	2.33	17.46	4.88	<0.05
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가.

표 6. 복합생균제 첨가급여 3주차 공시축의 유량 및 유성분
	대조구		시험구		유의성
	평균	표준편차	평균	표준편차	p-value
유량 (kg)	27.30	7.67	32.51	8.84	<0.05
유지방 (%)	3.31	0.47	3.25	0.70	<0.05
유단백 (%)	3.28	0.30	3.43	0.38	0.04
무지고형분 (%)	9.24	0.28	9.37	0.38	0.07
락토오스 (%)	4.78	0.17	4.83	0.22	0.28
체세포수 (×1,000)	306.29	833.35	111.14	140.66	0.07
MUN (%)	16.64	2.05	19.19	2.78	<0.05
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가.

표 7. 복합생균제 첨가급여 8주차 공시축의 유량 및 유성분
	대조구		시험구		유의성
	평균	표준편차	평균	표준편차	p-value
유량 (kg)	28.40	8.89	32.22	8.53	0.08
유지방 (%)	3.48	1.09	3.91	0.86	<0.05
유단백 (%)	3.36	0.35	3.45	0.33	0.09
무지고형분 (%)	8.97	0.42	9.03	0.40	0.39
락토오스 (%)	4.81	0.19	4.88	0.19	0.08
체세포수 (×1,000)	123.28	206.48	76.75	63.92	0.11
MUN (%)	16.67	2.29	22.19	2.39	<0.05
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가.

2) 사양시험 전기간 처리 효과

총 8주간의 사양시험을 통하여 얻어진 산유생산 성적들을 종합적으로 분석한 결과는 표 8에서 보는 것과 같다. 복합생균제의 사료첨가 급여는 착유우의 산유량을 유의적으로 증가시켰고(P<0.05), 유지방 함량은 증가하는 경향이 확인되었다(P=0.07). 유단백질 함량은 KSB90복합미생물 생균제 급여를 통하여 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(P<0.05). 체세포수의 경우, 매우 큰 산포도를 나타내었으나 (체세포수에 미치는 영향에 매우 복잡다양하다는 의미), 평균적으로 복합 생균제를 급여한 처리구에서 대조구에 비하여 낮게 나타났으며, 체세포수 감소의 확률은 약 88%인 것으로 확인되었다. KSB90복합미생물 생균제의 급여를 통한 유의적인 변화는 MUN(milk urea nitrogen)에서도 관찰되었으나, 번식 및 산유 성적에 부(-)의 영향은 없는 것으로 조사되었다.

표 8. 복합생균제 첨가급여시 공시축의 유량 및 유성분
	대조구		시험구		유의성
	평균	표준편차	평균	표준편차	p-value
유량 (kg)	27.85	8.09	31.05	9.07	<0.05
유지방 (%)	3.45	0.65	3.55	0.70	0.07
유단백 (%)	3.38	0.29	3.46	0.29	<0.05
무지고형분 (%)	9.32	0.39	9.30	0.38	0.29
락토오스 (%)	4.87	0.21	4.83	0.22	0.07
체세포수 (×1,000)	213.13	481.83	160.31	123.28	0.12
MUN (%)	17.58	2.46	19.27	4.23	<0.05
대조구, 무첨가; 시험구, 0.2% KSB90복합미생물 생균제 첨가.

○ 참고문헌

Bongaerts, G., R. Severijnen, and H. Timmerman. 2005. Effect of antibiotics, probiotics and prebiotics in treatment for hepatic encephalopathy, Med. Hypotheses 64: 64-68.

Chaney, A. L., and E. P. Marbach. 1962. Modified reagents for determination of urea and ammonia. Clinical Chemistry 8: 130-132.

Champbell, G. L. and M. R. Bedford. 1992. Enzyme applications for monogastric feeds. A Rev. Can. J. Anim. Sci. 72: 449-466.

Erwin, E. S., G. J. Marco, and E. M. Emery. 1961. Volatile fatty acid analyses of blood and rumen fluid by gas chromatography. Journal of Dairy Science 44: 1768-1771.

Fuller, R. 1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66: 365-368.

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